4 Técnicas moleculares

  • Extração do DNA
  • Amplificação
  • Eletroforese
  • Sequenciamento

4.1 Extração do DNA

  • O protocolo de extração de DNA é a primeira etapa do laboratório de análise molecular.

  • O “protocolo CTAB” solução tampão CTAB (Doyle and Doyle, 1987).

    • Maceração

      • Colocar 20–30 mg de material desidratado em sílica em microtubo (eppendorf) de 2 ml e 8–10 esferas de aço (2 mm)

      • Macerar no Mini-Beadbeater (BioSpec)

  • Adição do tampão CTAB

  • Centrifugar

  • Lavar o pellet

4.2 Amplificação

  • A Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é um procedimento para clonagem molecular.

  • Enzimas de restrição (tesouras moleculares)

    • Reconhecem e clivam diferentes sítios de restrição.

  • Primers (DNAs iniciadores)

  • Enzima DNA polimerase

    • Faz a replicação do DNA.

4.3 Eletroforese

  • Técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.

  • As amostras são colocadas nos poços localizados em uma das extremidades de um gel de agarose, e uma corrente elétrica é aplicada para que as amostras avancem pelo gel.

  • Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser vistos como bandas. Cada banda representa um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.

  • Para a visualização se utiliza a luz UV de um transiluminador.

A concentração da amostra é crucial para o sucesso da reação de sequencimento. Usar muito pouco DNA é um erro que leva a nenhum sinal ou a sinais fracos, mas usar muito é um erro também!

4.4 Sequenciamento

4.4.1 História do sequenciamento didesoxi Sanger

O sequenciador ABI utiliza o método de sequenciamento tradicional, proposto por Frederick e Sanger na década de 70, para gerar sequências entre 300 e 850pb. Na reação de sequenciamento são utilizados, além dos nucleotídeos comuns, nucleotídeos modificados e marcados com fluorescência, chamados dideoxirribonucleotídeos. Cada nucleotídeo (A, C, G, T) é marcado com um fluoróforo distinto. Durante a reação de extensão do fragmento de DNA, quando um nucleotídeo modificado é incorporado ao fragmento, o que ocorre de forma aleatória, a reação é interrompida. Os fragmentos de DNA gerados serão, portanto, de tamanhos diversos. Depois de separados por eletroforese capilar, uma câmera CCD (detector) acoplada ao equipamento irá identificar a fluorescência emitida pelo nucleotídeo marcado e assim caracterizá-lo (https://www.einstein.br/pesquisa/pesquisa-experimental/plataformas/plataforma-sequenciamento).

  • Os princípios de replicação do DNA foram usados por Sanger et al. no desenvolvimento do processo agora conhecido como sequenciamento didesoxi Sanger.

  • Esse processo aproveita a capacidade da DNA polimerase de incorporar 2’,3’-didesoxinucleotídeos – análogos de bases nucleotídicas que não possuem o grupo 3’-hidroxila essencial na formação da ligação fosfodiéster (DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis 3ed).

  • O sequenciamento de didesoxi Sanger requer um molde de DNA, um primer de sequenciamento, DNA polimerase, desoxinucleotídeos (dNTPs), didesoxinucleotídeos (ddNTPs) e tampão de reação.

  • Quatro reações separadas são configuradas, cada uma contendo nucleotídeos marcados radioativamente e ddA, ddC, ddG ou ddT.

  • As etapas de anelamento, rotulagem e terminação são realizadas em blocos térmicos separados.

    • A síntese de DNA é realizada a 37°C, a temperatura na qual a DNA polimerase tem a atividade enzimática ideal.
    • A DNA polimerase adiciona um desoxinucleotídeo ou o correspondente 2’,3’-didesoxinucleotídeo em cada etapa da extensão da cadeia.
    • A adição de um desoxinucleotídeo ou um didesoxinucleotídeo depende da concentração relativa de ambas as moléculas. Quando um desoxinucleotídeo (A, C, G ou T) é adicionado à extremidade 3’, a extensão da cadeia pode continuar. No entanto, quando um didesoxinucleotídeo (ddA, ddC, ddG ou ddT) é adicionado à extremidade 3’, a extensão da cadeia termina. O sequenciamento dideoxy Sanger resulta na formação de produtos de extensão de vários comprimentos terminados com dideoxynucleotídeos no final de 3’.

O sequenciador ABI (Applied Biosystems) é um instrumento baseado em laser que utiliza marcadores fluorescentes para analisar os produtos de uma reação de sequenciamento à medida que migram através de um gel. Depois que os dados são coletados a partir de uma execução de sequenciamento, o programa Analysis da Applied Biosystems identifica e rastreia os rastros (traces) de amostra do gel e, subsequentemente, normaliza e integra os dados brutos (raw data) em um cromatograma da sequência final.

Bases ambíguas tendem a ocorrer perto do final da sequência e podem ser editados ou excluídos pelo usuário antes de exportar os dados para outras comparações ou alinhamentos (Hagemann and Kwan, 1999).